β-D-葡聚糖是一种高效生物应答物(BRM)。其在免疫促进、抗肿瘤及预防糖尿病方面的效用,早已得到广泛认可。
我国啤酒工业每年能产生大约4×105吨废酵母,已有不少研究对其开展了回收蛋白质、核酸、维生素,以及其它可溶性营养物(用作添加剂)的实验,但对提取酵母β-葡聚糖的研究不多。这些残渣要么被廉价售作饲料,要么当垃圾处理,造成了环境的污染。因此,提纯酵母β-葡聚糖的研究意义重大。
β-1,3-葡聚糖不溶于水、酸、碱以及醇和醚等,在实际使用中广受限制。
Bao等使用化学修饰法提高了β-1,3-葡聚糖的溶解性,但该方法因过于剧烈,导致其生物活性也降低了,化学残留与污染也成问题。
由于β-1,3-葡聚糖酶可温和地修饰β-1,3-葡聚糖,并保持其生物活性,使其溶于水及其它溶剂,因此,酶法降解β-1,3-葡聚糖,在技术上和生物学方面都具有重大意义。不同来源的β-葡聚糖酶已被证实具有不同的活性。
可喜的是,胞外葡聚糖酶已经能成功地从真菌,如Cladorrhinum foecundissimum,Talaromyces emersonii和Rhizopus oryzae中提取。
该研究在啤酒厂不同排污口收集了10个样本,逐一筛选出产β-1,3-葡聚糖酶的菌株。选取的菌株采用平板培养,观察透明圈大小,选择产透明圈明显的菌落固态发酵,用改良的刚果红法测定β-1,3-葡聚糖酶活力。
粗酶提取的方法为:取固态发酵培养基,加入NaAc缓冲液于室温下浸提,用沃特曼滤纸过滤残余菌丝和颗粒。滤液在高速冷冻离心机中离心,上清液即为β-1,3-葡聚糖粗酶。
粗酶纯化方法为:粗酶液中添加(NH4)2SO4,在冷冻沉降机中离心,取沉淀溶于NaAc缓冲液,装透析袋透析。使用乙二醇(PEG600)脱水浓缩沉淀,DEAE-琼脂糖凝胶 CL-6B柱层析,洗脱液分别收集并脱水浓缩。
经SDS-PAGE分析,该酶分子量近似54.6KD。酶最适反应pH为5.0,最适温度为50℃。在pH3.0-5.0、温度30℃-70℃之间,酶活相对稳定。Fe3+、Mg3+、Mn3+及Cu3+对该酶有抑制作用,Zn3+、Ca3+和Fe3+则有一定的激活作用。
底物选择性研究表明,该酶为β-1,3、β-1,4-葡聚糖酶,可作用于含β-1,3、β-1,4糖苷键的底物,对含α-1,4和α-1,6糖苷键的底物无作用。
研究表明,利用分离自啤酒废水的木霉TP09生产的β-1,3-葡聚糖酶,可增强不溶性β-1,3-葡聚糖的可溶性,进一步促进了其在免疫疗法等领域的应用。
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