浅述对国产大麦多酚氧化酶酶学特性的初步研究(1)

　　PPO，即多酚氧化酶，是典型的铜结合氧化酶。它在植物中以单体、二聚体和四聚体的结构存在，且存在几种异构。

　　在大麦中，部分PPO以“潜伏”状态存在。而在浸麦过程中，可以通过除去一些酶抑制剂、蛋白酶作用或其他一些方式，使其活性在浸麦过程中增长。

　　在大麦发芽的过程中，PPO活性提高，对麦芽质量产生了重要影响。

　　大麦中的多酚物质经过PPO的催化氧化后，具有单宁性质，易和蛋白质起交联作用而沉淀出来，直接影响麦芽、麦汁的品质，进而影响啤酒的色泽、泡沫、风味和非生物稳定性。因此，研究PPO的酶学特性，不但能为选择优质的啤酒大麦品种提供重要依据，而且对提高麦芽和啤酒质量具有重要的意义。

　　本文，笔者以邻苯二酚为底物，通过分光光度计法，对国产大麦中多酚氧化酶（PPO）的酶学特性进行了研究，并同时建立了PPO活性测定方法，确定了大麦PPO的米氏常数Km为1.96mmol/L。

　　1.主要材料和仪器

　　1.1 主要材料：国产大麦

　　1.2 主要仪器：TS4－2型双控双温糖化试验器（北京发酵工业研究所），756MC型紫外可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司），HWS－250型智能恒温恒湿培养箱（宁波海曙赛福实验仪器厂）。

　　2.方法

　　2.1 多酚氧化酶酶液的制备

　　称取200g大麦，置于250mL烧杯中，用水冲洗3至4遍，然后加水置于培养箱中，将培养箱温度设置为16℃，加水浸麦。在大麦水分约达到38%时，结束浸麦，进入发芽阶段。培养24小时后，称取10g湿麦芽，用去离子水反复冲洗5遍以上，置于研钵中捣碎，将捣碎的麦芽放入糖化杯内，加去离子水90mL，0.2mol/L、pH5.0的醋酸－醋酸钠缓冲液10mL，于40℃恒温水浴保温搅拌1小时，然后过滤醪液，弃去最初的20mL滤液，保留最后得到的滤液，用以测定酶活力。

　　注意：在此操作过程中，所有容器均要求用去离子水冲洗至少3遍。

　　2.2 测定波长的选择

　　取磷酸缓冲液2mL，加入0.2mol/L的邻苯二酚溶液1.0mL、0.1mL，PPO滤液在室温下迅速混合均匀，并置于比色杯中，然后在波长为385nm—475nm间测定吸光值。

　　2.3 PPO活力的测定

　　0.1mL酶液与0.1mol/L的邻苯二酚（用pH7.6柠檬酸－磷酸缓冲液配制）溶液1.0mL，在80℃下反应3min，用2mL、20%的TCA终止反应，于415nm下用分光光度计测定吸光值。

　　酶活力单位定义：上述条件下，将每分钟ΔA值增加0.01，定义为1个酶活力单位U（绝干）。

　　2.4 PPO的酶学性质

　　2.4.1 底物浓度与PPO活力的关系

　　在酶浓度一定时，配制浓度分别为2mmol/L、4mmol/L、10mmol/L、15mmol/L、20mmol/L、30mmol/L、40mmol/L、50mmol/L的邻苯二酚溶液测定PPO活力。

　　2.4.2 酶浓度与PPO活力的关系

　　在底物浓度一定时，依次添加1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL的酶液，参照PPO活力的测定方法，测定PPO活力。

　　2.4.3 pH和温度与PPO活力的关系

　　采用双因素全面性实验方法：用柠檬酸－磷酸缓冲液制备不同pH、不同温度的邻苯二酚溶液，pH值分别为6.4、6.8、7.2、7.6、8.0、8.4，反应温度为70℃、80℃、85℃、90℃，参照PPO活力的测定方法，检测PPO活力。

　　2.4.4 酶催化反应时间的确定

　　参照PPO活力的测定方法，每30s测定一次吸光值，共测18次，可得到9min的PPO的酶促反应速率曲线。

　　2.4.5 PPO的热稳定性

　　PPO在沸水中保温2min、3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min，水浴保温至上述时间后，立即冷却至室温，测定PPO活力。

　　2.46 不同添加剂对PPO活力的影响

　　在反应体系中，分别加入不同浓度的柠檬酸、抗坏血酸，参照PPO活力的测定方法来测定PPO活力。