浅述对国产大麦多酚氧化酶酶学特性的初步研究(2)

　　3.结果与分析

　　3.1 测定波长的选择

　　体系反应产物在可见光波385nm—475nm下的吸光值如图1所示。可以看出，体系产物在可见光波长为415nm处，有最大的吸收峰，即在此波长下，体系产物吸光度最大。因此，选取415nm为测定PPO活力的最佳可见光波长。



　　3.2 底物浓度与PPO活力的关系

　　底物浓度对反应速率的影响、反应速度与底物浓度双倒数关系分别见图2、图3。

　　由图2可见，在底物浓度很低时，PPO反映速率与底物浓度间呈一次线性关系。原因是当底物浓度很低时，酶是过量的，反映速率由底物的量决定。随着底物浓度的增加，越来越多的酶分子与底物相结合，反应速率逐渐趋向一个最大值，此时进一步增加底物浓度，对反应速率的影响很小，体系由一级反应转变为零级反应，并表现出零级反应的动力学特征，符合Michaelis－Menten机理。

　　

　　依据米氏方程，由图3得到动力学反应方程：[1/V]=0.0204[S]+0.0104,R2=0.9868。

　　依据直线的截距，求得反应的米氏常数Km=1.96mmol/L。

　　3.3 酶浓度与PPO活力的关系



　　大麦PPO活力与酶液添加量的关系见图4。可以看出，当反应体系中PPO酶液添加量小于6mL时，底物浓度过大，反应速率由酶添加量决定；而当PPO酶添加量大于6mL时，反应速率由底物决定，但由于反应产物对酶活力有抑制作用，因此导致酶活力略有降低。所以，当酶添加量为6mL时，PPO全部被底物饱和，且需要酶添加量最小，酶活力最大。因此，在保持反应体系中其他成分不变的条件下，酶添加量≤6mL也可以用来测定大麦PPO的活力。

　　3.4 pH和温度与PPO活力性的关系



　　pH和温度对大麦PPO活力的双因素全面性影响见图5。可以看出，大麦PPO酶活力随温度的升高而升高，但超过一定温度后，酶活力反而下降。这是因为随着温度的升高，酶反应得到了加速，同时也加速了酶的变性，在80℃时有最大酶活力。同时也可看出，随着pH的升高，PPO的活力同样出现先增加后降低的变化趋势。pH为7.6时，酶活力最大，这说明PPO为碱性蛋白质，在较强的酸性条件下，辅基铜将以铜离子的形式解离出来，从而使酶失活，而在碱性条件下，辅基铜将会解离成Cu（OH）₂，使酶活力降低。由此得出，PPO最适反应温度和pH参数分别为80℃和7.6。