桑椹发酵酒污染菌的分离纯化鉴定及控制方法研究(1)

　　一、前言

　　果酒酿造是一个复杂的生物工程，酿造微生物种类繁多。不同酒种生长的微生物也不尽相同，不同的原料自身会带有不同的菌群，这些菌群自始至终参与酒的发酵，不同的菌群发酵代谢的产物也各不相同，这些产物给发酵的质量、风格带来了重大影响。

　　桑椹为多年生木本植物，其成熟果子果肉多汁、皮薄娇嫩。而由于桑棋富含多种营养物质，加之采摘期间高温潮湿，成熟果易腐烂、霉变，从而造成发酵的污染及陈酿酒的感染等，因此会改变桑椹酒风味，并破坏发酵酒的生物稳定性，损害发酵酒的品质。因此，研究与鉴定污染桑椹果酒的微生物种，查找发酵酒的污染源，了解污染微生物的代谢规律，找出有效控制果酒被污染的方法，对提高桑椹酒的品质及企业经济效益具有十分重要的意义。

　　二、桑椹发酵酒污染菌的分离鉴定方法

　　1.材料与方法

　　1.1 主要仪器设备

　　T－200型电子天平，752紫外光栅分光光度计，电热恒温培养箱，电热鼓风干燥箱，可控硅控温水浴锅，电子调温万用电炉，光学双筒显微镜，高速组织捣碎机，微生物净化室，手提式灭菌锅，JYT－架盘药物天平，旋涡混合器，酒精计，精密pH计，家用冰箱。

　　1.2 样品的采集

　　宁波天宫庄园果汁果酒有限公司被污染的发酵酒，分别从33＃、42＃、88＃、107＃罐取出。

　　1.3 培养基

　　1.3.1 细菌培养基

　　（1）MRS培养基：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母浸膏5g，葡萄糖10g，吐温－80 1g，磷酸氢二钾2g，乙酸钠5g，柠檬酸三铵2g，MnSO4.H2O 0.2g，MgSO4·7H2O 0.04g，琼脂20g，pH6.3，蒸馏水1000mL。

　　（2）营养琼脂培养基（NA）：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂20g，pH 7.2—7.4，蒸馏水1000mL。

　　（3）WLN培养基：葡萄糖50g，酵母提取物4g，蛋白胨5g，FeCl3·6H2O 0.0025g，KCl 0.425g，MgSO4·7H2O 0.125g，MnSO4 0.0025g，CaCl2·2H2O 0.125g，琼脂20g，pH5.5—5.8，蒸馏水1000mL。

　　1.3.2 真菌用培养基

　　（1）土豆培养基（PDA）：200g土豆切碎后，加800mL水，100℃煮沸1h后，用一层纱布过滤，然后加入20g葡萄糖，最后用蒸馏水定容到1000mL。

　　（2）察氏培养基（CPK）：NaNO3 3g，K2HPO4 1g，KCl 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，蔗糖30g，蒸馏水1000mL。

　　1.4 平板分离培养方法

　　（1）稀释分离：取数支无菌空试管排列于试管架上，根据待稀释的浓度分别依次标明10-1、10-2、10-3、10-4、10-5，并向试管中各加入9mL无菌生理盐水。

　　用1mL无菌吸管精确吸取1mL已充分混匀的文章来源华夏酒报待测酒样，注入10-1试管中。然后，另取1支无菌吸管，于10-1试管中来回吹吸三次，使之混匀，即成10-1稀释液。再从10-1试管中吸1mL注入10-2试管中，重复上述操作，直至制成10-２、10-3、10-4、10-5稀释液。

　　（2）倾注平板：取无菌培养皿若干套，每3套为一组，在每组皿底分别写上稀释度，再用对应的1mL无菌吸管分别吸取10-1、10-2、10-3、10-4、10-5稀释液各1mL，对应放入编好号的无菌培养皿中，尽快向上述盛有不同稀释度菌液的平皿中倒入融化后冷却至45℃—50℃左右的培养基，每皿约15mL，置水平位置迅速旋转平皿，使培养基与菌液混合均匀，而又不使培养基荡出或溅到皿盖上，待培养基凝固。

　　（3）涂布平板：用对应的1mL无菌吸管分别吸取10-1、10-2、10-3、10-4、10-5稀释液各0.1mL，对应放入已编好号的预先制备好的空白平板中，迅速用无菌玻璃涂布棒（将玻璃涂布棒沾取酒精，在酒精灯火焰上灼烧，在培养皿上盖上冷却后使用）将稀释菌液均匀地涂抹在整个培养基的表面，至稀释液完全被吸收。

　　（4）培养：倒置于恒温培养箱中培养（细菌用37℃，真菌用30℃），观察菌落形态和分散状况，挑取单菌落转接斜面。

　　（5）计数：数各皿中的菌落数，算出同一稀释度3个平皿上菌落的平均数，按照计数报告原则计算结果。

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