桑椹发酵酒污染菌的分离纯化鉴定及控制方法研究(4)

　　2.1 细菌平板分离培养结果

　　用添加放线菌酮或制霉菌素的MRS、WLN和NA三种培养基，采用倾注和涂布两种方式对两批次待测酒样中的细菌进行培养，对各个稀释度下长出的单菌落分别计数结果见表1、表2、表3、表4。







　　细菌平板分离培养结果显示，在第一批样品42＃和88＃中，88＃酒液中存在约65个/mL细菌，其中厌氧型的比例较高；在第二批的四个样品中，污染现象普遍存在，其中88＃和107＃严重污染，细菌污染数量级分别高达104/mL和106/mL，其中只能在营养要求较苛刻的MRS培养基上厌氧生长的细菌比例很高。

　　对平板分离培养中获得的污染细菌，按照菌落形态的不同进行划分，共有3种不同的细菌，分别编号为B-1、B-2、B-3，待进一步鉴定。

　　2.2 污染细菌的鉴定

　　对污染细菌B-1、B-2、B-3的菌落形态、显微形态、革兰氏染色特性及过氧化氢酶反应进行测定，结果见表5和图1。

　　



　　运用16S rDNA序列分析进行分子鉴定，结果见表6。鉴定结果显示，果酒中的污染细菌为产乳酸细菌，是酿造环境中的常见污染菌。

　　

　　2.3 真菌培养分离结果

　　用土豆培养基和察氏培养基进行真菌的分离培养，在培养基中添加链霉素抑制细菌生长，同时添加去氧胆酸钠抑制菌落的蔓延，以便于分离和计数，检测结果见表7、表8。



　　真菌平板分离培养结果显示，在33＃和42＃酒样中未发现污染真菌，而在88＃和107＃酒样中存在多种污染真菌，污染程度都在102/mL数量级以上。对平板分离培养中获得的污染真菌，按照菌落形态的不同进行划分，共有10种，分别编号为W-1—W-10，挑出不同真菌，进行分离纯化，纯菌株待进一步鉴定。

　　2.4 污染真菌的鉴定

　　对分离获得的污染真菌菌株进行纯培养，运用分子鉴定与形态鉴定相辅的多相分类鉴定方法，对W-1—W-10进行鉴定，结果见表9。



　　从表9可以看出，分离获得的W-8和W-9含量很高，达到106/mL，鉴定结果显示为酿酒酵母，是果酒的正常生产菌，并非污染菌。而W-5异常毕赤酵母是酿酒业的有害菌。此外，酒样中还存在种类众多的霉菌污染，包括黑曲霉、烟曲霉、赛氏曲霉、微小根毛霉和三种青霉菌，其中部分霉菌的污染浓度不低，达到103/mL，在酒体中主要以孢子形式存在，通常这类污染菌主要来源于酿造原料所携带的霉菌孢子，是在栽培和成熟过程中自然形成和携带的。