桑椹发酵酒污染菌的分离纯化鉴定及控制方法研究(2)

　　1.5 分离培养实验流程（图1）



　　1.6 细菌的部分生理生化鉴定

　　（1）形态观察：在洁净无脂的载玻片中央滴一小滴蒸馏水，用接种环以无菌操作从枯草芽孢杆菌斜面上挑取少许菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜，涂布面积约1cm2—1.5cm2，室温自然干燥。

　　手执载玻片一端，使涂菌一面向上，通过火焰2至3次；将涂片置于水平位置，滴加结晶紫染色液，染色1min左右。倾去染液，斜置载片，用自来水的细水流由载片上端流下，不得直接冲洗在涂菌处，直至载片上流下的水无色为止。自然干燥，也可用滤纸吸干，注意不要擦掉菌体，待标本片完全干燥后，先用低倍镜和高倍镜观察，将典型部位移至视野中央，再用油镜观察。

　　（2）革兰氏染色：革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法，是细菌分类和鉴定的基础。通过革兰氏染色可把细菌区分为两大类，阳性菌和阴性菌。染色时，先用结晶紫初染、次经碘液媒染、再用95%乙醇脱色、最后用蕃红复染。经过此法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；若细胞染上复染的红色细菌，则为革兰氏阴性菌。

　　将细菌接种营养琼脂斜面，培养约24h。取洁净载玻片，滴加一滴生理盐水，用接种针挑少量菌体于水滴中，均匀涂散，制成细菌涂片，自然干燥后，在酒精灯灯焰上快速来回通过3至4次再固定。于制片上滴加结晶紫染液，使其覆满涂片区域，染色1min—2min后，用细水流冲洗，加路哥氏碘液覆盖染色约1min，细水流冲洗，用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，直接用95%乙醇从载玻片上端冲洗脱色，直到流下的酒精无明显的紫色时，立即水洗。脱色是革兰氏染色中最关键的一步。滴加番红染液，复染色1min—2min，水洗，用滤纸吸干，油镜镜检。

　　（3）过氧化氢酶实验：过氧化氢酶能催化H2O2分解成水和氧。测定是否存在过氧化氢酶，是微生物种属分类的依据之一，主要用于区分乳酸菌、厌氧菌及其他细菌。将斜面上保藏物接种于营养琼脂和MRS培养基斜面上，于30℃培养24h，滴数滴3%H2O2于斜面菌体上，观察是否有气泡产生，若有气泡为阳性，无气泡则为阴性，以不接种的空白营养琼脂和MRS培养基斜面作为对照。

　　1.7 污染微生物的分子鉴定

　　（1）菌株基因组DNA的提取：采用氯化苄法抽提DNA。用接种针刮取一环斜面纯培养物于相应的液体培养基中，摇瓶过夜。培养物离心或抽滤，收集菌（丝）体，超纯水洗涤3遍后，转入7mL离心管中，加入2.5mL提取液（100mmol/L Tris-HCl pH8.0，40mmol/L EDTA pH8.0  2%SDS）振荡混匀后再加入1mL10%SDS和2mL氯化苄，50℃保温1h（每10min上下颠倒混匀），加入1mL3mmol/L的NaAc，冰浴15min，9.8×103g离心15min，取上清加入等体积的异丙醇，室温放置20min，9.8×103g离心15min，弃上清，加入70%乙醇洗涤，离心15min，弃上清，室温放置15min后，加入50μL TE溶解。0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

　　（2）rDNA片段的PCR扩增：分别采用细菌通用引物p6（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和p7（5’-AAGGAGGTGATCCAGCC-3’）扩增细菌纯培养物的16S rDNA片段，真菌通用引物pITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和pITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）扩增真菌纯培养物的rDNA-ITS片段。PCR扩增体系：反应体系50μL，其中40μL ddH2O、5μL10×PCR Buffer、1μL 4×dNTP、1μL pITS1、1μL pITS4、1μL模板DNA。先95℃变性5min后，取出在冰上加入1μL Taq酶，94℃，30s；58℃，30s；72℃，45s，共30个循环，然后在72℃延伸10min，4℃暂时保存，保存于-20℃备用。PCR反应结果用2%的琼脂糖凝胶电泳检测，254nm的紫外灯下观察，拍照。

　　（3）PCR产物纯化：在PCR反应管中加入200μL的PB液，混匀。将PCR反应管中的液体全部移入吸附柱，9000×g，离心15s，丢弃收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。在吸附柱中加入PB液400μL，静置1min后，9000×g，离心15s。丢弃收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。在吸附柱中加入W1液600μL，静置2min后，9000×g，离心15s。丢弃收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。9000×g，离心2min，将吸附柱放入新的1.5mL离心管中，在吸附膜中央加入30μL T1液，静置5min后，9000×g，离心2min。将DNA保存于-20℃备用。