桑椹发酵酒污染菌的分离纯化鉴定及控制方法研究(3)

　　（4）纯化产物柱式胶回收：割下含目的DNA片断的琼脂糖凝胶，放入1.5mL离心管中，称重。按每100mg琼脂糖加入600 μLS1液，55℃水浴10min，完全溶解。加入1/3S1体积的异丙醇，混匀。55℃水浴10min，将融化后的凝胶移入吸附柱，9000×g离心1min。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。

　　在吸附柱中加入450μL的W1液，静置1min后，9000×g离心15s。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中，再在吸附柱中加入450μL的W1液，静置1min后，9000×g离心15s。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中，9000×g离心1min。将吸附柱放入新的1.5mL离心管中，在吸附膜中加入30μL的T1液，室温静置5min，9000×g离心2min，将DNA保存于-20℃备用。

　　（5）与pUCm-T载体连接：连接体系为10μL。在微型离心管中加入以下成分：pMD18-T Vector 0.5μL，DNA模板4.5μL，5μL的Ligation SolutionⅠ，16℃连接过夜。

　　（6）转化：采用CaCl2法预先大量制备E.coli JM109的感受态细胞，取出一支100μL已制备好的保存在-70℃超低温冰箱中的感受态大肠杆菌，放在冰上加入DNA连接液10μL，冰上放置30min。然后42℃，90s。0℃，2min。加入LB液体培养基400μL，放置在37℃摇床上，150r/min，45min，将离心管中的液体全部涂布在含Amp、IPTG、X-Gal（浓度均为100mg/mL）的LB固体平板上，37℃培养过夜。

　　（7）挑菌、扩增：观察培养皿上的转化子生长状况，在超净台上用接种针从每个培养皿上挑取3个白色克隆子，放入含有Amp的2mL LB液体培养基的小试管中，37℃，180r/min摇床上培养8h。

　　（8）质粒抽提：将培养好的细菌全部倒入2mL的离心管中，9000×g离心1min。弃上清，在细菌沉淀中加入250μL的P1液，立刻彻底振荡悬浮。加入250μL的P2液，立刻温和上下颠倒离心管5次—10次，混匀，室温静置4min，加入350μL的P3液，立刻温和上下颠倒离心管5次—10次混匀。12000×g离心15min。将上清液小心地移入吸附柱，9000×g离心15s，倒掉收集管中的液体，将吸附柱移入同一个收集管。在吸附柱中加入400μL的B1液，9000×g离心15s。再在吸附柱中加入300μL的W1液，9000×g离心15s。倒掉收集管中的液体，将吸附柱移入同一个收集管中。在吸附柱中加入600μL的W1液，静置1min后，9000×g离心15s。倒掉收集管中的液体，将吸附柱移入同一个收集管。9000×g离心1min。将吸附柱放入一个新的1.5mL的离心管中。在吸附膜中央加入50μL的T1液，室温静置5min，9000×g离心1min。将提好的质粒放在-20℃保存备用。

　　（9）PCR法鉴定插入片断：以抽提的质粒为模板，用PCR法鉴定质粒中是否有插入片断，条件参照（2）。

　　（10）序列测定和同源性分析：将含插入片断的质粒，送宝生物工程（大连）有限公司进行序列测定。测序结果经DNAMAN3.0软件去载体后，将序列提交GenBank数据库，利用Blastn软件进行序列比对。

　　2.研究结果

　　对两批次六份样品：第一批的42#（灭过菌的样品）、88#（未灭菌样品）和第二批的33#、42#、88#、107#分别用细菌培养基和真菌培养基进行平板分离培养检测，分离获得其中的污染微生物纯种并检测污染程度。